三、無血清培養基
1979年神經細胞培養出現了一個重要進展，用化學添加劑即可維持神經細胞存活與生長而不需要在培養基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養物和促貼壁的物質的組合置換培養基中的成分，后找到了適合大多數細胞培養的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經細胞培養，早是用在B104大鼠神經母細胞瘤細胞系的培養。它的基礎培養基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。

未料到的是上述配方構成的培養基可以支持神經母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發展了能支持原代培養的各種神經元生長的培養基，這種培養基在許多實驗室里已取代了有血清培養。在某些培養方案中，細胞直接進入無血清培養，這樣的培養基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經元免遭環境毒物損傷的制劑。于神經元的培養基在某些培養環境中還可以減低非神經元細胞的增殖，故可使神經元純化。

血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養基中。當缺乏這些成分時，如神經元在無血清培養基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養細胞的存活。有學者發現細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養時變小，特別是神經元與膠質共培養時，它們可以吸收和代謝神經元毒性物質如谷氨酸。

應該注意，盡管無血清培養基是有化學限定性的，但在培養過程中它仍有變動，培養起始時可能有些物質缺乏，而后細胞的產物可能積累，從而使培養基的成分改變。這其實是有另一方面的好處，即條件培養基（已培養過細胞的培養基）的形成，條件培養基常常用來增加神經元和膠質細胞的發育。

生長因子絕大多數哺乳類胚胎神經元有嚴格的營養要求，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分，將會使絕大多數神經元在體外培養的數天中死亡。解決這一問題有兩條思路，一是讓培養細胞提供自己的營養因子，二是在培養基中加入純的生長因子。如果細胞混合物能在高密度時生長，所需的生長因子便會積累到可觀的數值，尤其當培養基很少變化時。若某種細胞混合物生長時有很少的營養需求，可保持培養基在一段時間里不作任何變動，以使營養（生長）因子積累，而后促使所需要的細胞類型能夠生長。但是，這種對營養（生長）因子自身倚賴性亦有弊端，因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖，某些細胞會因生長條件的貧乏而受限制。另外，這種方法只能進行相當高密度的細胞培養。因為培養基的條件在細胞的較低密度時變的不夠有效。不過某些時候純化神經元群體的低密度培養可用條件培養基（經過了高密度培養）進行，或在膠質上生長的神經元所用過的培養基來支持。

滿足神經元營養需求的第二條途徑是向培養基中加入生長因子。通常用于組培的通用適宜因子是神經生長因子NGF。不過，只有少數對這種蛋白質有反應的細胞類型的細胞才能生長。

許多PNS類型的神經元在離體狀態時表現出簡單的營養需求，只需提供單一的營養因子就足以使其在低密度時增殖。例如，大鼠交感神經元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經元可在嚴格局限條件下生長好幾個月（即在無血清培養基中、或缺乏膠質細胞、或在化學限定基質上）。有證據表明NGF是活體中交感神經元存活的生理調節因子。然而，交感神經元也對來自膠質細胞的神經營養因子（GDNF）有反應，還有NT3、LIF與CNTF也對其有作用。在不產生GDNF或NT3的動物中，交感神經元會有損傷。在離體與活體營養需求之間的差別或許可以用在不同環境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養中的NGF彌散在整個環境中，而在活體內，大部分區域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數實驗中已經習慣了營養因子的大效應使用量，其他營養因子的協同效應在亞優劑量下更容易觀察到。此外，高濃度的營養因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應的，低濃度的營養因子可能用來檢查表現型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應。有許多其他的PNS培養系統只需單一營養因子就可使有實用價值的細胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經節神經元和大鼠背根神經節感覺神經元。不過，這些模型也有局限性。例如，培養中的睫狀神經節的神經元加入CNTF時，超過90%的神經元能存活一個很長時期，但并未有跡象表明它屬于內源的靶細胞來源的營養因子，而是有爭論的相關分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經節含有好幾種細胞群體，其中小細胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應，但其他神經元，例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經營養因子有反應。因此，在大多條件下培養物的生長并不能忠實反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細胞培養中特別突出，因為已有的經驗表明，沒有一種培養基能適合于所有類型及亞類的神經細胞的生長。

現有的證據已表明，CNS神經元的營養需求比PNS的更復雜。對脊髓運動神經元與視網膜節細胞神經元的研究表明，這些神經元與外周神經元相比能對更為廣泛的營養因子起反應。例如，至少發現了15種不同的分子可在離體條件下增加神經元的存活。而且，已觀察到運動神經元與視網膜對任何單獨的營養因子的存活反應，與PNS中所觀察到的典型反應相比，都要小得多。因此，大多數影響運動神經元及視網膜節細胞的營養因子僅僅只能支持神經元的亞群，而神經元的達到一定存活要求諸多因子的結合。在視網膜節細胞的培養中，因子的合適組合（如BDNF、CNTF、IGF、bFGF）包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結果的普遍性尚待進一步的證實，但敲除單一的營養因子基因之后，沒有表現出對CNS大多類群的神經元的存活產生太大影響，這一觀察與上述的事實是一致的。現已知少突膠質細胞的長期存活也需要眾多營養因子的相互作用。