蛋白酶K，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩定，還具有降解天然蛋白質的能力，因而它應用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體 DNA，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(pH 4-12.5)均有活性。推薦反應緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶K配制標準：20mg/ml蛋白酶K配制標準(proteinase K)：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反復凍融，有效保證12月。
孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時。
作用：蛋白酶K在原位雜交技術中通常用于雜交前的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用，以增加探針與靶核酸結合的機會，提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時，都會對細胞的結構有一定的破壞，導致組織切片的脫落，細胞核 的消失，從而影響雜交結果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現的問題，并能達到理想的染色效果。
蛋白酶K的應用比較廣泛，它可以消化包圍靶DNA蛋白，因此使用蛋白酶K能夠增加探針 與靶核酸結合的機會增強雜交信號，但在使用蛋白酶K時要主要使用的濃度，過高或者過低都會破壞細胞的結構、核消失等影響試驗結果。
