143B人骨肉瘤細胞系

143B人骨肉瘤細胞系

無菌操作基本技術 
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 
5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

1、請問工作濃度的胰酶是不是應保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是幾個小時就會失去活性？
平時放在-20度，分裝在50毫升螺口管，用時拿一管放4度用。
2. 粉末培養基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但*也不要超過3-4個月，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，細胞嬌弱，經驗表明放置時間不宜過長。認真按照操作規程進行實驗，一般不大會導致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養基有污染而使實驗失敗，
 3. 關于實驗用品的清洗與消毒，我的經驗是：用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后，自來水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。
許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當然如果money有限，如進口的培養板、皿等，也可以重復使用1-2次，我當時使用方法是將其*清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過多次，沒有出現問題。塑料培養瓶由于清洗消毒不便，*不要重復使用，如一定要重復用，可用環氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)。

在光鏡下，上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布，細胞之間有拉絲現象（即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連），細胞有成片生長的特性。而間質細胞通常呈梭形，沒有有成片生長的特性，細胞之間的聯系不緊密。但是細胞的形態特征會因為生長條件的改變而改變，如HeLa細胞是上皮細胞，但是在酸性培養條件下會變為梭形。上皮細胞之間都有特征性的緊密連接（橋粒）結構，因此可以通過觀察培養細胞的超微結構來判斷細胞的類型，如果有緊密連接，就必然是上皮細胞。這是一錘定音的證據。注意不要把細胞消化下來做電鏡，要用細胞刮刮下來后做電鏡。此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達（cytokertin, CK）,可以查一下子宮內膜腺上皮細胞表達的CK分子，然后進行免疫細胞化學的鑒定。
細胞在偏堿的情況下培養，耐受能力會逐漸下降，可能是產生脫壁現象的原因，后來我重新測了一下培養基，為7.5左右，我用滅菌的HCL調了一下，培養基顏色變成淡紅透亮，再次培養，發現細胞貼壁比較好了，搏動效果也不錯，因此，我以后每次培養前都要重新調好PH值，我覺得很多因素是能影響PH值的。
血清質量不好，影響了細胞生長。所以，我認為以后養細胞，用的血清濃度*是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻為準，畢竟國產的血清質量差異比較大啊。
細胞無菌操作是關鍵，對于配制培養液時，有些人為了讓培養粉充分溶解，攪拌4小時或更長時間。其實這*沒有必要，一般培養基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時間長了會增加污染機會，雖然后來濾過除菌了，但細菌的代謝產物比如脂多糖誰能夠把它濾掉？細菌的代謝是很快的，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的經驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。
另外關于培養基的pH問題，一般按照說明書操作，加入所說的NaHCO3量，與預計的pH不會有什么距離，也就是說基本上不用調pH，如果相差大，要考慮三蒸水的質量是否有所下降，當然這時調pH也是不得已而為之。我配培養基時基本上不調pH，只是用試紙檢測一下pH，觀察一下培養基的顏色。

（1）東西一定要用自己的。既不要借別人的，也不要借給別人。可能大家覺得比較自私。實際上還是很有好處的。并不是每個人的操作都規范，因此相互之間串著用，很容易造成交叉污染。
（2）我習慣口對口倒液體，在倒前倒后都要在酒精燈上過一下。自己認為比起用吸管吸更能很好的防止污染。步驟越簡單，越能防止污染。而且還能節省很多吸管。
（3）一次將所有的所需要試劑、工具放入工作臺。不要做到半路，又出工作間拿東西，這樣增加了污染的機會。
（4）整個操作要快、動作要輕、而且不要干其他的事情。比如手機響了，*不要接。我一般操作的時候將手機關了，手機聲音響起，好煩躁。
（5）我一般開紫外線照射臺的時候，就將培養基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來了。有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用它的也一定要勤換水。從水域鍋那出后，*找個毛巾插干上面的水。
（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作臺，要打掃衛生。
細胞要經常凍存，我一般只要細胞狀態好就將細胞凍存起來。細胞狀態差了，扔掉，重新復蘇。這是一個必須養成的習慣。畢竟很多情況下，細胞并不是因為污染了，才讓你感到頭痛。這樣你不會擔心沒有種子了。我一般是不加雙抗的，只要注意，不會污染。

過濾時不要用槍吹細胞!! 如果用力吹,篩網就像刀片一樣,把你的細胞全部切碎!!

.刷玻璃器皿的過程：初洗、泡酸（一天）、自來水沖洗（10遍）、純化水沖洗（3遍）、注射用水沖洗（3遍）。感覺過于苛刻，自來水只沖洗3遍。被老師發現后，一陣痛批，才知道這是極其關鍵的一步，殘留的酸可能會抑制細胞生長，甚至導致細胞死亡，痛失辛苦得來的細胞，心血付之東流。無知不能無畏，一定不能大意。

做好準備工作。不要急于投身到細胞培養中去，要先設定計劃：步驟，工具，試劑。特別是將細胞用于大規模生產時，尤其如此。經過干熱滅菌的容器一般認為可以在一周內保持無菌狀態，如果準備多了，用不完的就得重新滅菌，耗費能源、占用滅菌空間，不值得；干熱滅菌需要一天的時間，當器皿準備不足時，只能干著急，錯過了蕞佳操作時間，也許得很久才能將細胞狀態再調整好。

對于驕氣的細胞，我一般都是*天處理完后，加少量培基（夠蓋住瓶底部），第二天換液，以免死細胞和碎片對活的產生不良影響。

新配的培養基直接用很清亮，但是在－20度保存一段時間后再溶解就要出現很多雜質，用37度水孵育沒有效果，握在手里不停搖動非常有效。其實對于操作熟練的人來說，污染并不是我們想像那樣容易出現，園子里很多人都問否污問題，而培養基的PH值往往被忽略，而且大多數人都習慣于一次配制1升培養基，分裝成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出現結晶，鏡下看就是一些桿狀的物資，有時候晃動培養基，肉眼就可以看到很多沉淀，這就需要我們在用之前好好搖勻了。

細胞凍存： 當細胞細胞狀態好，或者代數比較早，一定要大量凍存，不要吝惜暫時的大批使用血清，當細胞狀態不好，長不起來的時候，馬上取出來復蘇，省時省力，不要去嘗試努力恢復狀態不好的細胞，費時間也費血清，會令你痛苦不堪。另外凍存的細胞不要放到一個地方，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一點，誰也不敢保證不出意外，冰箱也可能有化的時候（我們－20度冰箱就化過），都放在一塊容易全軍覆沒。 

按照試劑的保存標準保存，像血清、胰酶等沒開封的-20℃，開封后-4℃保存一般不超過7天（用完它吧，不然浪費了）
5、一定要弄清楚每個組分的作用，特點，比如NaHCO3容易分解，因此培養基在過濾除菌時pH會上升，一般是0.1-0.3，所以在過濾之前，要把培養基的pH調低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特點，就不會做相應的處理，那么培養基不符和要求，細胞就長不好
臺盼藍主要用來鑒定原代培養細胞時,細胞分離后的存活情況，用0.4%臺盼藍直接染色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察即可，活細胞不被染色。方便易用，因此在實驗室中比較常用，尤其在心肌細胞原代培養中。