caki-1人腎透明細胞癌皮膚轉移細胞

細胞縮寫：    Caki-1細胞
    細胞名稱：    Caki-1(人腎透明細胞癌皮膚轉移細胞)
    詳細背景：    超微結構中包含許多微絨毛，少許微絲，許多小線粒體，充分發育的高爾基休和內質網，許多脂滴和多層體，次級溶酶體，沒有發現病毒顆粒。
    細胞來源：    細胞主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數國內外著名大學建系
    "購買細胞注意事項：
1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和我們聯系。
2. 仔細閱讀細胞說明書，細胞了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、血清比例、所需細胞因子等。
3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題貼壁細胞會有少量從瓶壁脫落，將細胞置于培養箱內靜置培養過夜，隔天再取出觀察。此時多數細胞均會貼壁，若細胞仍不能貼壁請用臺盼藍染色測定細胞活力，如果證實細胞活力正常，請將細胞離心后用新鮮培養基再次貼壁培養；如果染色結果顯示細胞無活力，請拍下照片及時和我們聯系，信息確認后我們為您再免費寄送一次。
4. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和公司技術部溝通交流。"    P4
    包裝規格：    復蘇T25培養瓶(一瓶)或凍存1ml凍存管（兩支）
    細胞規格：    1*10(5)/ml——1*10（6）/ml
    安全水平：    1
    細胞種屬：    人
    組織來源：    腎透明細胞癌皮膚轉移
    細胞形態：    上皮細胞樣
    細胞特性：    貼壁
    細胞融合度：    95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）
    細胞檢測：    細胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌
  caki-1人腎透明細胞癌皮膚轉移細胞

 "細胞培養三不要：
養科研細胞是生物醫學研究的基本功。有三個小經驗可以和大家分享一下：
1. 不要燒瓶口。大多數人都喜歡在酒精燈的火焰上關瓶子，覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養基怎么越用越發紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。培養基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時候，熾熱的空氣進入瓶內。塞緊塞子放入冰箱后，空氣變冷，壓力驟降，培養基中的碳酸就會轉化成二氧化碳，釋放出來。培養基中的碳酸少了，當然會變堿。如果不燒瓶口的話，你會發現培養液變堿的速度會大大減慢。（當然多多少少還是會有一點越用越堿，因為室溫還是比冰箱內的溫度高）
其實燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下，你會發現根本就不會燒疼。如果有細菌的話，這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細菌，除非把瓶口和塞子燒紅。我在國內從來就不燒瓶口。來美國以后發現這里更*，超凈臺內根本就不點酒精燈。
2. 不要頻繁看細胞。對于初學者而言，養細胞就像養孩子一樣，有空就要去看看。細胞越是養不好，就越是經常去看。實際上看細胞對細胞的生長沒有任何好處，特別是對原代細胞或是免疫磁珠分選后，密度特別低的細胞。培養基中的生長因子是非常有限的。細胞好不容易自分泌一點兒促生長的因子在其周圍，形成有利于生長的局部環境。你跑去看細胞，培養瓶這么一晃，把因子都給晃散了。經常可以看到新手一天到晚都在看細胞，細胞老是長不好。老手細胞一扔好幾天不管，細胞瘋長。
3. 不要怕消化。在傳代的時候，初學者往往生怕細胞消化過度，早早地終止消化。細胞沒下來就使勁吹燈，吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來，用力吹打對細胞的損傷比消化更大。我師兄在做血管平滑肌原代的時候，37度消化過夜，細胞也沒事。我一般是等細胞*變圓后才中止消化。細胞輕輕一晃就能下來。還有，動作要輕柔，盡量不要產生氣泡。氣泡在破裂時的機械應力相當大，對細胞的傷害也是很大的。"    詳見細胞說明書
    傳代方法：    建議1:2-1:3 兩天換液一次
    凍存條件：    詳見細胞說明書
    主要文獻：    請具體查閱相關發表文章
傳代細胞培養操作步驟

1、        37度水浴加熱所有試劑。
2、        吸取培養培養皿內舊培養液，放置一個干凈離心管內。（為稍后終止消化作準備。）
3、        用PBS清洗培養皿，棄去。
4、        向瓶內加入消化液（胰蛋白酶液）。以能覆蓋培養瓶底為宜。（一般一個大皿1ml）
5、        2-5分鐘后，輕輕震蕩培養皿。使細胞從瓶壁脫離形成細胞懸液。顯微鏡下觀察若細胞由貼壁變為懸浮就加入血清（即原培養液）終止消化。
6、        收集細胞懸液，880轉/分、5分鐘離心，棄去上清液。
7、        加培養液至1ml，混勻后取10ul計數細胞。
8、        根據實驗要求取適量細胞留種或接種于新的培養皿或96孔板、24孔板中，再加入相應體積的培養液。（90mm大皿是9ml，中皿好像是4mm，6孔板和小皿是2ml，96孔板是100ul）。
9、        接種好的培養皿順時針和逆時針各轉三圈，使細胞排列均勻。
10、        放入暖箱中繼續培養。
細胞計數步驟：
1、將計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上.
2、將細胞懸液吸出少許，用臺盼蘭溶液對被稀釋后滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。(臺盼蘭用于標記死亡細胞。)
3、鏡下觀察，計算計數板八大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：
細胞數/ml＝8大格細胞總數/ 8×2×10000
細胞凍存與復蘇：
凍存和復蘇的原則：慢凍快融
當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶很大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。
　1．凍存細胞
（1）選對數增生期細胞，在凍存前1d換液。
（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×106／m1左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞成再懸液。凍存細胞時培養液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m1懸液。
（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，作好標記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min時間內,下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。
標準程序：
當溫度在-25℃以上時， 1～2℃/min
當溫度達-25℃以下時， 5～10℃/min
當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中
簡易程序：
將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。
　　操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復蘇細胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細胞懸液注入離心管中,再滴加10 m1培養液。
（4）低速離心(880r／min) 5 min，去上清后再用培養液洗一次。
（5）用培養液適當稀釋后，裝入培養瓶37℃培養，次日更換一次培養液后，繼續培養。以后仍按常規進行培養。
　　凍存細胞數量要充分，密度應達到107／m1，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×105／m1數量。