WiDr人大腸癌細胞

測定方法.

一、細胞凋亡的形態學檢測

根據凋亡細胞固有的形態特征,人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法.

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體.貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落.

（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態.

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

 一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況.

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的,主要結合在DNA的A-T堿基區.紫外光激發時發射明亮的藍色熒光.

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml.DAPI為半通透性,用于常規固定細胞的染色.儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml. 結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）,部分染色質出現濃縮狀態；aⅡ期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；bⅡ期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體細。

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 細胞處理方法：

一、貼壁細胞
1、 接收到細胞，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規范，打開細胞培養瓶。
4、37度平衡1-2小時。
5、用移液管吸取培養基，到50ml離心管中，剩下細胞密度達到80%至90%可以傳代，如沒有達到添加6ml新鮮培養基繼續培養。
6、如果肉眼檢查上清有細胞，對50ml上清進行離心收集細胞，如果細胞連片狀態，棄掉上清對收集的細胞進行胰酶消化（1ml胰酶37度），接種培養。

二、懸浮細胞
1、接收到細胞，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規范，打開細胞培養瓶。
4、細胞培養瓶內的培養基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒）。
5、1000rpm，5min 離心，用吸管小心吸出上清，加入培養基，重懸細胞。
6、將重懸好的細胞轉入六孔板或者細胞培養瓶種，加入新鮮培養基，置于 37℃，5%CO2 培養（大部分細胞）。