23132/87細(xì)胞， 腺癌；惡性腺瘤

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異，有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買(mǎi)，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，策略是進(jìn)行低溫保存。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

一、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，最小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來(lái)凍存細(xì)胞。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下:

包含10%甘油的*培養(yǎng)基，

包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基，

50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是:

50% 細(xì)胞條件無(wú)血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基，或

包含有7.5%二甲基亞砜和10%細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。

23132/87細(xì)胞， 腺癌；惡性腺瘤

1、懸浮細(xì)胞

計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以大約200~400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞。

以1×10⁷到5×10⁷細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在無(wú)血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。

分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開(kāi)始冷凍步驟。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

2、貼壁細(xì)胞

使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到最小。

在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。

以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞。

以5×10⁶到1×10⁶細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。

分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開(kāi)始冷凍步驟。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

二、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑(DMSO或甘油)敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長(zhǎng)培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×10⁵活細(xì)胞/ml。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí)，更換新鮮的*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，去除凍存劑。

2、離心方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。

三、細(xì)胞的分化、衰老與死亡

1、細(xì)胞的分化:一個(gè)成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個(gè)，可以區(qū)分為200多種不同類(lèi)型的細(xì)胞:形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細(xì)胞均來(lái)自一個(gè)受精卵細(xì)胞。所以，通常把發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞分化。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個(gè)過(guò)程在人的一生中一直持續(xù)著。

由旺盛生長(zhǎng)不斷分裂的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中G1期開(kāi)始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細(xì)胞周期。旺盛生長(zhǎng)分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)各不相同。

2、細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明:

成纖維細(xì)胞:來(lái)自胎兒傳代50次后衰老死亡,來(lái)自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來(lái)自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來(lái)自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細(xì)胞衰老過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的變化，包括:蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn);同時(shí)，細(xì)胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。

細(xì)胞衰老原因，尚無(wú)定論，出現(xiàn)過(guò)好幾種理論與假說(shuō)，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說(shuō)”。

3、細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個(gè)體存活的正常現(xiàn)象，常見(jiàn)的細(xì)胞死亡形式有3種:壞死、凋亡和細(xì)胞毒性。多細(xì)胞生物的生命活動(dòng)中，因?yàn)榄h(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死亡，稱(chēng)為細(xì)胞的病理死亡，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡;細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件，不依賴(lài)于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。