以下實驗方案介紹了貼壁培養哺乳動物細胞傳代的一般流程。請注意昆蟲細胞與哺乳動物細胞傳代的一些關鍵步驟有所不同。更多信息請參閱下一頁的“昆蟲細胞傳代的注意事項”部分。

為自己所用的細胞系傳代時，建議您嚴格遵守實驗中所有產品附帶的操作說明。偏離某種細胞所需的培養條件會導致細胞表型異常，甚至培養*失敗。

所需材料      ：裝有貼壁細胞的培養容器

              ：經過組織培養處理的培養瓶，培養板或培養皿

  ：*生長培養基，預熱至37℃

  ：一次性無菌15-ml試管

  ：37℃培養箱，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣

  ：平衡鹽溶液，例如：杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（DPBS），不含鈣、鎂和酚紅  

  ：解離劑，例如：胰蛋白酶或TRYPLE™EXPRESS,不含酚紅

              ：用于活細胞和總細胞計數的試劑和設備，例如：countess™||自動細胞計數儀、臺盼藍染料或血球計數器。

貼壁細胞傳代流程    所有與細胞接觸的溶液和設備均為無菌狀態。必須采用正確的無菌技術，并且在層流通風櫥內工作。

1. 從培養容器中吸出用過的細胞培養基并丟棄
2. 用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液沖洗細胞（每10cm ²)培養表面面積需要2ml溶液）。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次。

注：沖洗步驟可去除可能抑制解離劑作用的少量血清、鈣和鎂。

1. 從培養器中吸出沖洗液并丟棄。
2. 向培養瓶中加入預熱的解離劑（例如：胰蛋白酶或tryple™）；試劑量應足以覆蓋細胞層（每10cm2大約0.5ml）。輕輕搖晃容器，使試劑*覆蓋細胞層。
3. 將培養容器在室溫下孵育約2分鐘。請注意實際孵育時間根據所用細胞系不同而有所差異。
4. 在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90％，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況，也可輕輕拍打培養容器以加快細胞解離。
5. 細胞解離程度大于90％時，傾斜培養容器，使細胞上液體盡快流盡。加入所用解離劑兩倍體積的預熱*生長培養基。吹打細胞層表面數次，使培養基分散。
6. 將細胞轉移到15-ml錐形管中，以200×g的離心力離心5至10分鐘。請注意離心速度和時間依細胞種類不同有所差異。
7. 用少體積的預熱*生長培養基重新懸浮細胞沉淀，取出少量樣品進行計數。
8.   采用血球計數器、細胞計數儀按照臺盼藍拒染法或者使用countess™||自動細胞計數儀測定總細胞數和活細胞百分比。必要時，可再次向細胞中加入生長培養基，以便達到所需的細胞溶度，并重新進行計數。

注：我們建議使用countess™||自動細胞計數儀測定細胞數和活細胞百分比。Countess™||自動細胞計數儀計數所需的樣本量與您目前使用的血球計數器所需量相同，且不到10秒鐘即可完成一個樣本的典型細胞計數，適用于各種真核細胞。

             11：將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細胞懸液轉移到新的細胞培養容器中，把細胞放回培養箱。

             注：如果使用培養瓶，將其放入培養箱前應將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通風式培養瓶和透氣性瓶蓋。

貼壁昆蟲細胞傳代的注意事項

雖然昆蟲細胞傳代的一般步驟與哺乳動物細胞相同，但是這些培養系統的一些關鍵要求有所不同。為了獲得滿意結果，實驗中必須嚴格遵守所有產品附帶的操作說明。

1. 昆蟲細胞應在對數期傳代。但是，如果培養的是強貼壁性昆蟲細胞，則應在細胞達到匯合狀態或者剛剛開始從培養瓶底部脫離時進行傳代，因為此時細胞容易脫離。
2. 細胞密度低于匯合狀態的20％時，細胞生長會受到抑制。健康狀態的細胞是對數期收獲的細胞。
3. 培養昆蟲細胞時建議不要二氧化碳交換。
4. 昆蟲細胞應于27℃、非濕化環境中培養。在避光條件下可將細胞放在操作臺上或者放入抽屜中于室溫下培養。但是，建議使用溫度控制在27℃的環境。
5. 使用昆蟲細胞的培養基。
6. 在無血清培養條件下，昆蟲細胞與基質貼附極為牢固，需要花費較大力氣才能使其脫落。要使細胞脫落，可以采用拍掌的動作快速振搖一下培養瓶。為了避免污染，進行此操作前必須蓋緊蓋子。

  警告：建議不要劇烈搖晃培養瓶，因為這樣可能會造成細胞損傷。

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