懸浮細胞的傳代

              懸浮細胞傳代比貼壁細胞傳代稍微簡單一些。由于細胞已經在生長培養基中的懸浮，因此無需通過酶的作用使其從培養容器表面脫離，整個過程較為迅速，對細胞的損傷也較小。懸浮培養時不進行生長培養基的更換；而是每2到3天加料一次，直到細胞匯合。可以直接在培養瓶中稀釋細胞，然后繼續培養擴增，或者也可以從培養瓶中取出一部分細胞，將余下的細胞稀釋到該細胞系適宜的接種密度。懸浮細胞的傳代后的延滯期一般比貼壁細胞要短。

懸浮細胞培養容器

              懸浮培養可采用未經組織培養處理的無菌培養瓶（例如：不嗲折流板的搖瓶）進行；但是，專為懸浮細胞培養設計的轉瓶（攪拌瓶）具有出色的氣體交換功能，可進行較大規模的細胞培養。

             轉瓶有兩種基本設計；其培養基由懸掛的攪拌棒或者垂直的葉輪攪拌（即攪動）。垂直葉輪的換氣效果更佳。轉瓶總培養體積不能超過轉瓶標示體積的一半，以便換氣充分（例如：500ml轉瓶中培養液體不能超過250ml）。  

所需材料     

1. 裝有懸浮細胞的培養容器
2.  不帶折流板的搖瓶或者轉瓶
3. *生長培養基，預熱至37℃
4. 37℃培養箱，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣
5. 磁力攪拌盤（如果使用轉瓶）、滾架（如果使用滾瓶）或者搖床（如果使用傳統培養瓶或者培養皿）
6. 用于活細胞和總細胞計數的試劑和設備（例如：countess™||自動細胞計數儀、臺盼藍染料或血球計數器。）

懸浮細胞傳代流程

             所有與細胞接觸的溶液和設備均應為無菌狀態。必須采用正確的無菌技術，并且在層流通風櫥內進行。傳代應在細胞處于對數期、未達到匯合狀態時進行。達到匯合狀態時，懸浮培養的細胞會聚集成團塊，轉動培養瓶時培養基會變得渾濁。傳代前所建議的大細胞密度隨細胞系不同而有所差異。

            使用搖瓶進行細胞培養時

                                   以下實驗方案介紹了利用振蕩培養箱和搖瓶進行哺乳動物細胞懸浮培養時傳代的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體的產品說明書。

注：應確保搖瓶中無折流板（即：位于培養瓶底部用于攪動的齒形板），因為折流板會破壞搖動節奏。

1. 當細胞適合傳代（即：處于對數生長期未達到匯合狀態）時，從培養箱取出培養瓶，使用無菌吸管從培養瓶中取出少量細胞樣品。如果吸取樣品前細胞已經沉淀，應轉動培養瓶，使細胞在培養基中均勻分布。
2. 通過此樣品，采用countess™||自動細胞計數儀或者血球計數器、細胞計數儀按照臺盼藍拒染法測定總細胞數和活細胞百分比。
3. 計算將細胞稀釋到推薦接種密度時需要加入的培養基體積
4. 在無菌狀態下將適量預熱的生長培養基加入到培養瓶中。必要時可將培養的細胞分到多個培養瓶中。
5. 將培養瓶的瓶蓋旋開一圈，以便進行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋），并將培養瓶放回振蕩培養箱。搖晃速度取決于具體的細胞系。

      注：為了盡量減少細胞碎片和無用的代謝副產物在振蕩培養體系中蓄積，每三周（或者必要時）應將細胞懸液輕輕離心一次，離心力為100×g，時間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長培養基重新懸浮細胞沉淀。

       使用轉瓶進行細胞培養時

 以下實驗方案介紹了利用轉瓶進行哺乳動物細胞懸浮培養時傳代的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體的產品說明書。

     請注意細胞對物理剪切作用很敏感。應確保葉輪可自由轉動，不會觸碰到容器壁或底部。葉片頂部應稍微高于培養基。以確保培養系統換氣充分。調節轉動裝置，使葉片不會觸碰容器和底部。下表列出了不同尺寸轉瓶所需的小培養基體積。

我們建議開始旋轉培養時轉瓶容器不要超過500ml。建議從方法成熟、體積較小的轉瓶開始逐步擴大培養規模。

1. 當細胞適合傳代（即：處于對數生長期而未達到匯合狀態）時，從培養箱中取出培養瓶，使用無菌吸管從培養瓶中取出少量細胞樣品。如果吸取樣品前細胞已經沉淀，應轉動培養瓶，使細胞在培養基中均勻分布。
2. 通過此樣品，采用countess™||自動細胞計數儀或者血球計數器、細胞技術儀按照臺盼藍拒染法測定總細胞和活細胞百分比。
3. 計算將細胞稀釋到推薦接種密度時需要加入的培養基體積
4. 在無菌狀態下將適量預熱的生長培養基加入到培養瓶中。必要時可將培養的細胞分到多個培養瓶中
5. 將培養瓶的瓶蓋旋開一圈，以便進行充分的氣體交換，并將培養瓶放回培養箱。轉速取決于所用細胞系和葉輪類型。應確保轉速始終在推薦值范圍內，以免剪切應力導致細胞損傷。

注：為了盡量減少細胞碎片和無用的代謝副產物在振蕩培養體系中蓄積，每三周（或者必要時）應將細胞懸液輕輕離心一次，離心力為100×g，時間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長培養基重新懸浮細胞沉淀。

懸浮昆蟲細胞傳代的注意事項

                     雖然昆蟲細胞傳代的一般步驟與哺乳動物細胞相同，但是這些培養系統的一些關鍵要求有所不同。為了獲得滿意結果，實驗中必須嚴格遵守所用昆蟲細胞系附帶的操作說明。

1. 進行細胞懸浮培養時無需更換培養基。定期傳代時需要吸出細胞懸液，然后加入適量培養基，將細胞稀釋到適當密度。添加新鮮培養基后可使細胞營養素達到*補充。
2. 培養昆蟲細胞時建議不要用二氧化碳交換。
3. 昆蟲細胞應于27℃、非濕化環境中培養。可將細胞放在操作臺上或者放入抽屜中于室溫下培養。但是，建議使用溫度控制在27℃的環境。
4. 使用昆蟲細胞的培養基。
5. 使用表面活性劑降低剪切作用。進行昆蟲細胞旋轉培養時建議使用0.1％pluronic™。F-68pluronic™ F-68（BASF)是一種表面活性，可降低葉輪導致的細胞膜剪切作用 注：sf-900||SFM和expressFive™ SFM中已經含有表面活性劑。
6. 某些昆蟲細胞可能需要一定的過程來適應懸浮培養。更多信息，請參閱針對具體細胞的產品說明書或操作手冊。
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